జన్యు ఇంజనీరింగ్‌లో పురోగతి
అందరికి ప్రవేశం

నైరూప్య

ఫ్రాటాక్సిన్ జన్యువులో వ్యాధికారక GAA రిపీట్‌ను తొలగించడంలో CjCas9 వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడానికి రెండు మార్గాలు

Pouiré Yaméogo

 ఫ్రాటాక్సిన్ జన్యువు యొక్క మొదటి ఇంట్రాన్‌లో GAA రిపీట్ సీక్వెన్స్ (GAAr) చొప్పించడం వల్ల చాలా ఫ్రెడరిక్ అటాక్సియా కేసులు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణలో తగ్గుదలకు దారితీస్తాయి. CRISPR-Cas9 సాంకేతికత ద్వారా ఈ GAAr యొక్క తొలగింపు ఫ్రాటాక్సిన్ వ్యక్తీకరణలో పెరుగుదలకు దారితీస్తుంది. AAV ప్యాకేజింగ్ పరిమిత పరిమాణం కారణంగా, SpCas9 ద్వారా GAAr తొలగింపుకు రెండు అడెనో-అనుబంధ వైరస్‌లు (AAVలు) అవసరం. 2 AAVలను ఉపయోగించడం వలన సంభావ్య చికిత్స యొక్క సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది, ఎందుకంటే ప్రతి కణం తప్పనిసరిగా రెండు వైరస్‌ల ద్వారా సోకింది. కాబట్టి మేము CjCas9ని ఉపయోగించాము ఎందుకంటే ఇది ఒకే AAV ద్వారా రెండు sgRNAలతో పంపిణీ చేయబడేంత చిన్నది. అయినప్పటికీ, వివోలో AAV ద్వారా పంపిణీ చేయబడిన CjCas9 జన్యువు యొక్క నిర్మాణాత్మక వ్యక్తీకరణ ఆఫ్-టార్గెట్ ఉత్పరివర్తనాలను పెంచుతుంది మరియు Cas9 ప్రోటీన్‌కు వ్యతిరేకంగా రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను ప్రేరేపిస్తుంది. CRISPR సిస్టమ్‌కు తాత్కాలిక వ్యక్తీకరణ ముఖ్యమైనది. న్యూక్లీస్ వ్యక్తీకరణను పరిమితం చేయడానికి మేము రెండు విధానాలను పరిశోధించాము.

మొదటిది, మాలిక్యులర్ హర కిరీ, CjCas9 ఎన్‌కోడింగ్ చేసే HeLa కణాల ప్లాస్మిడ్‌లలో మేము ఏకకాలంలో బదిలీ చేసాము, ఫ్రాటాక్సిన్ జన్యువును లక్ష్యంగా చేసుకుని రెండు గైడ్‌లు (ప్రీ మరియు పోస్ట్ GAAr) మరియు CjCas9 జన్యువును లక్ష్యంగా చేసుకుని రెండు గైడ్‌లు. CjCas9 జన్యువు యొక్క స్వీయ-విధ్వంసం ఉన్నప్పటికీ, FXN జన్యువు యొక్క సమర్థవంతమైన జన్యు సవరణ విట్రోలో పొందబడిందని మా ఫలితాలు చూపించాయి.

రెండవది, CRISPR-SCRET (స్టాప్ కోడాన్ రీడ్ త్రూ), మేము దాని వ్యక్తీకరణను అణచివేయడానికి CjCas9 జన్యువు ప్రారంభంలో స్టాప్ కోడాన్ (TGA)ని చొప్పించాము. తదనంతరం, మేము అకాల స్టాప్ కోడాన్ ఉన్నప్పటికీ అనువాదాన్ని అనుమతించగల అణువుల ద్వారా Cas9 యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించాము. ఈ ప్లాస్మిడ్ రెండు sgRNAలతో (ప్రీ మరియు పోస్ట్ GAAr) 293T కణాలలోకి బదిలీ చేయబడింది. G418తో చికిత్స చేయబడిన సెల్‌లలో మాత్రమే GAAr యొక్క తొలగింపును మేము గుర్తించాము.

ఈ విభిన్న పద్ధతులు స్థిరమైన Cas9 వ్యక్తీకరణను నిరోధించేటప్పుడు ఫ్రాటాక్సిన్ జన్యువు యొక్క సమర్థవంతమైన సవరణను పొందేందుకు అనుమతించబడ్డాయి. ఇది ఆఫ్-టార్గెట్ మ్యుటేషన్‌ల అవకాశాలను మరియు Cas9 ప్రోటీన్‌కు వ్యతిరేకంగా రోగనిరోధక ప్రతిచర్యను తగ్గిస్తుంది.