బయాలజీ & మెడిసిన్లో అధునాతన సాంకేతికతలు
అందరికి ప్రవేశం

నైరూప్య

వివోలో β 1-అడ్రినెర్జిక్ రిసెప్టర్ ఫాస్ఫోరైలేషన్ స్థితిని నిర్ణయించడానికి వ్యూహం

కోజో హయాషి మరియు హిరోయుకి కోబయాషి

β1-అడ్రినెర్జిక్ రిసెప్టర్ (Adrb1), G-ప్రోటీన్ కపుల్డ్ రిసెప్టర్ (GPCR) సూపర్‌ఫ్యామిలీలో సభ్యుడు, గుండె పనితీరు యొక్క క్లిష్టమైన నియంత్రకం. అన్ని GPCRలు బహుళ సైట్‌లలో ఫాస్ఫోరైలేట్ చేయబడతాయి మరియు ఫాస్ఫోరైలేషన్ యొక్క నిర్దిష్ట నమూనా కణజాల-నిర్దిష్ట పద్ధతిలో గ్రాహక పనితీరు మరియు దిగువ శారీరక ప్రక్రియలను నియంత్రించడానికి "బార్‌కోడ్" వలె పనిచేస్తుంది. అయినప్పటికీ, నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలు లేకపోవడం వల్ల vivoలోని Adrb1 ఫాస్ఫోరైలేషన్ సైట్‌ల స్థానం మరియు పనితీరు గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు. Adrb1 యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్ స్థితులను మరియు ఇన్ వివో మౌస్ హార్ట్‌లోని అనుబంధిత విధులను గుర్తించడానికి మొదటి దశగా, మేము ఈ క్రింది ప్రయోగాత్మక వ్యూహాన్ని అభివృద్ధి చేసాము: 1) అధునాతన ఫాస్ఫోప్రొటోమిక్స్ పద్ధతులను ఉపయోగించి వివిక్త పెర్ఫ్యూజ్డ్ మౌస్ హార్ట్‌లో అగోనిస్ట్-ఆధారిత Adrb1 ఫాస్ఫోరైలేషన్ సైట్‌లను గుర్తించడం; 2) Adrb1- ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్ HEK 293T కణాల నుండి పొందిన అధిక-నాణ్యత మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) డేటా ద్వారా ఈ ఫాస్ఫోరైలేషన్ సైట్‌ల యొక్క ఖచ్చితమైన కేటాయింపు; 3) జీవిలో ఫాస్ఫోరైలేషన్ స్థితిని బహిర్గతం చేయడానికి ఇమ్యునోఆఫినిటీ శుద్దీకరణ కోసం N- టెర్మినస్ వద్ద FLAG-ట్యాగ్‌తో ఫ్యూజ్ చేయబడిన Adrb1ని వ్యక్తీకరించే నాక్-ఇన్ (KI) ఎలుకల తరం; 4) ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ పెప్టైడ్ యొక్క MS కొలతలు మరియు సంబంధిత అన్‌ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ పెప్టైడ్ అయాన్ తీవ్రత నిష్పత్తుల ద్వారా KI మౌస్ హార్ట్‌లోని Adrb1 యొక్క నిర్దిష్ట సైట్‌లలో ఫాస్ఫోరైలేషన్ స్థాయిలను వివరించడం. ఈ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించి, మేము Adrb1 యొక్క C-టెర్మినస్ వద్ద Ser462ని పెర్ఫ్యూజ్డ్ మౌస్ హార్ట్‌లో అగోనిస్ట్-ఆధారిత ఫాస్ఫోరైలేషన్ సైట్‌గా గుర్తించాము. మేము KI ఎలుకలలో Ser274 (0.25), Ser417 (0.55) మరియు Ser462 (0.0023) వద్ద బేసల్ ఫాస్ఫోరైలేషన్ నిష్పత్తులను కూడా వెల్లడించాము. ఈ పరిశోధనలు సైట్-నిర్దిష్ట ఫాస్ఫోరైలేషన్ ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించిన Adrb1 ఫంక్షన్ యొక్క రెగ్యులేటరీ మెకానిజమ్‌లపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి.